Фильм посвятили памяти Мако, который не дожил до премьеры фильма.

Это 4-й фильм о черепашках. Первые 3 фильма не имели компьютерной анимации, а были сделаны при помощи высоких кукольных технологий (аниматронные головы как часть костюма черепашки, мимикой кукловоды управляли дистанционно).

У Леонардо, Рафаэля и Донателло глаза карие, а у Микеланджело — голубые. Режиссёру мультфильма хотелось, чтобы Микеланджело выглядел моложе и безобиднее остальных.

За день до смерти номинированного на премию «Оскар» актёра Мако 21 июля 2006 года было объявлено, что на международном ежегодном фестивале Comic-Con в Сан-Диего Сплинтер будет говорить его голосом. Авторы фильма успели снять Мако практически во всех сценах фильма «Черепашки-ниндзя», где действовал его персонаж.

Первое появление на экране Караи. Это приёмная дочь Шреддера в мультсериале «Мутанты черепашки ниндзя. Новые приключения!» (2003–2009), которая приезжает из Японии после смерти Шреддера в комиксах.

Центральная композиция мультфильма «Shell Shock» группы Gym Class Heroes начала своё существование как рэп-импровизация, которую они исполнили на одном из концертов.

За первый уикенд в прокате мультфильм побил все кассовые рекорды в США, собрав 25,45 миллиона долларов.

Во всех предыдущих фильмах франшизы мультипликация чередовалась с игрой актёров. Это первый полнометражный компьютерный мультфильм за 14 лет. События в нём происходят после тех, о которых рассказано в прежних фильмах.

Джим Каммингс стал единственным актёром, оставшимся в фильмах франшизы с момента его первого появления в мультсериале 1987 года, где он озвучил Кожеголового, лягушку по имени Чингиз и частично Шреддера.

Первый фильм франшизы, где компьютерной графикой занимались специалисты «Imagin Animation Studios».

Был самым высокобюджетным фильмом франшизы до появления экшн-фильма Джонатана Либесмана «Черепашки-ниндзя» (2014).

Имена генералов Юатля переводятся с испанского следующим образом: Агила — орёл, Гато — кот, Серпьенте — змей, Моно — обезьяна.

Несмотря на то, что действие мультфильма разворачивается в Нью-Йорке, на экране появляется только одна реально существующая городская достопримечательность — Бруклинский мост. Весь остальной городской ландшафт является плодом воображения авторов.

В жилище черепашек-ниндзя можно увидеть изображение боевого робота Зевса, персонажа мультсериала «Центрикс» (2001-2004), созданного «Imagi Animation Studios».

Кевин Манро полагал, что выберет другого актёра озвучивать Сплинтера. «Это будет лучше, чем искать актёра с голосом, похожим на голос Мако, потому что такого просто не найти», — сказал он однажды.

От одной идеи для сюжета последующих фильмов франшизы автор сценария Питер Лэрд уже категорически отказался. Речь идёт о путешествии черепашек-ниндзя в прошлое, во времена расцвета цивилизации майя, куда одновременно телепортируются пришельцы-захватчики. Как вспоминал однажды Кевин Манро, Лэрд на это предложение сказал: «Это мы уже проходили в 1992 году» (в фильме «Черепашки-ниндзя 3» 1992 года).

Английское название фильма состоит из аббревиатуры TMNT, которую часто употребляют поклонники черепашек-ниндзя. Это единственный фильм франшизы, включая телесериалы и фильмы (за условным исключением сериала «Черепашки-ниндзя: Новая мутация» 1997-1998 годов), в названии которого нет слов «черепашки-ниндзя».

Кейси произносит фразу «А я-то думал, это только страховые агенты такие наглые!», когда на него с Рафаэлем нападают. Эту же фразу произносит Микеланджело, когда в квартиру Эйприл врываются члены Клана Футов в фильме Стива Бэррона «Черепашки-ниндзя» 1990 года.

В самом конце Рафаэль произносит фразу «Классно быть черепахой!»(I love being a turtle!). Эту же фразу Микеланджело произносил в первом фильме, и все черепашки (после победы над Супер-Шреддером) во втором фильме.

Как заявил режиссёр мультфильма Кевин Манро в комментариях на DVD, песенка, которую Сплинтер напевает, входя на кухню, это старинная японская колыбельная. Мако исполнил её экспромтом.

В мультфильме героям противостоят 13 чудовищ, некоторые из них мифологического происхождения. Это можно сказать о снежном человеке, который появляется в недостроенном здании, ещё одно является циклопом, голубей на крыше пожирают горгульи, а чудище в кафе очень напоминает легендарного дьявола из Джерси.

В время схватки Ночного Всевидящего с чудовищем в кафе на монстра падает холодильник, музыка обрывается, и зритель слышит, как чудовище издаёт хнычущие звуки. Звуки появились из-за какого-то сбоя в саундтреке, но авторам мультфильма они так понравились, что было решено оставить их в мультфильме.

По большей части облик Сплинтера соответствует тому, что зрители видели в прежних фильмах (где его тело покрыто бурым мехом), однако в этом мультфильме он одет в кимоно, а не в тряпьё, как прежде. Кроме того, в отличие от прежних появлений на экране здесь у Сплинтера целое правое ухо. Кевин Манро как-то пошутил, что Сплинтер сделал себе отопластику (восстановление ушной раковины или недостающих её частей).

В финале Рафаэль произносит фразу «Мы наносим удар и растворяемся в ночи». Этими же словами заканчивается первый комикс о черепашках-ниндзя.

Как сказал режиссёр в комментарии на DVD, в одном из первых вариантов сюжета предполагалось, что Рафаэль погибнет, а Донателло применит технологии Макса Винтерса, чтобы вернуть его к жизни. Вскоре один из авторов сценария Питер Лэрд отверг этот поворот сюжета. Ему не понравилась мысль, что кто-то из главных героев погибнет.

Некоторые реплики в мультфильме взяты из прежних фильмов, где мультипликация чередовалась с игрой актёров. Во время схватки с Кланом Футов Кейси Джонс говорит: "Две минуты за игру высоко поднятой клюшкой!"- фразу, которую он уже произносил. Последней репликой фильма становятся слова Рафаэля "Классно быть черепахой!" Эта же фраза звучит во всех предыдущих фильмах франшизы.

Сюжет будущего фильма «Черепашки-нинзя 2» должен в общих чертах повторять сюжет «Войны в городе», саги комиксов, состоящей из 13 частей. Чувствуя определённое отчуждение, Микеланджело полагает, что его никто не воспринимает всерьёз. Руководствуясь наилучшими побуждениями, он сбегает от братьев и присоединяется к Клану Футов и надевает бандану чёрного цвета. Черепашки-ниндзя в это время отправляются в Японию, где сталкиваются с Карай, а заканчивается всё возвращением их давнего врага Шреддера. В следующем после этого фильме предусмотрено появление трицератонов, и также прибытие из Измерения Х Технодрома, сферической передвижной крепости. Толчком ко всем этим событиям послужат действия Донателло. Кевин Манро хотел, чтобы командующий Технодромом говорил с экрана голосом Майкла Кларка Дункана. Он даже придумал постеры для фильма «Черепашки-ниндзя 2» ("блестящий после дождя асфальт, крышка канализационного люка, а рядом с ним оранжевая бандана Микеланджело") и его продолжения ("Технодром и маленькие фигурки черепах вдалеке").

В первом эпизоде с Ночным Всевидящим, когда преступники уже разбегаются, на одной из вывесок магазинов вдалеке написано «monro» хираганой (это японская слоговая азбука). По всей видимости, имеется в виду режиссёр Манро.

Некоторые поклонники считают, что этот фильм является свободным продолжением оригинальной трилогии, которое не учитывает событий, описанных в телесериале «Черепашки-ниндзя: Новая мутация» (1997-1998), и что действие фильма разворачивается в отдельной вселенной. Это не так. В конце фильма на экране появляются предметы, знакомые зрителю по прежним фильмам — шлем и посох Шреддера, маска члена Клана Футов, канистра мутагена, который изменил облик главных героев и Сплинтера (на ней стоит аббревиатура TCRI, а не TGRI, то есть Techno Global Research Industries, хотя пробоина на боку канистры на букве «C» позволяет разночтения), скипетр времени, шляпа Уокера, шлем повелителя Норинаги, а также части доспехов, которые черепашки-ниндзя носили в третьем фильме франшизы.